Заражение куриного эмбриона микробиология. Развитие цыпленка в яйце по дням, фото и видео
Большинство известных вирусов обладают способностью размножаться в курином эмбрионе (рис.4). Используют эмбрионы в возрасте от 8 до 14 дней в зависимости от вида вируса, способа заражения и задач исследования. Вирусы гриппа культивируются в 9-10, оспо вакцины - в 12, паротита - в 7-дневных куриных эмбрионах. Размножение вируса в куриных эмбрионах происходит в разных частях зародыша, что связано с особенностями тропизма вируса . Методику выращивания вируса в курином эмбрионе широко используют при промышленном культивировании.
Строение куриного эмбриона и способы его заражения: 1 - в амнион ; 2 - в аллантоисную полость; 3 - в желточный мешок. (Микробиология и иммунология. Под редакцией Воробьева А.А. - М. - 1999).
Самая наружная внезародышевая оболочка, примыкающая к скорлупе или материнским тканям и поэтому служащая местом обмена между зародышем и окружающей его средой, называется Хорионом. У видов, откладывающих яйца, основная функция хориона — осуществление дыхательного газообмена. У млекопитающих хорион участвует в дыхании и питании, выделении, фильтрации и синтезе веществ. У примитивных организмов хорион - вторичная оболочка, а у продвинутых - оболочка плода. Полость между хорионом и амнионом - хорионамниотическая.
Амнион (греч. Amnion), Амниотический мешок или Водная оболочка — одна из зародышевых оболочек у эмбрионов пресмыкающихся, птиц, млекопитающих.
Эволюционно амнион возник для защиты эмбрионов от высыхания при развитии вне водной среды. Поэтому позвоночных животных, откладывающих яйца (рептилии и птицы), а также произошедших от рептилий млекопитающих относят к группе амниот («Животные с яйцевыми оболочками»). Предшествующие классы и надклассы позвоночных (головохордовые, круглоротые, рыбы, земноводные) откладывают икру в водную среду, поэтому им не требуется водная оболочка. Эти классы животных объединяют в группу анамний. В отличие от анамний амниотам не требуется водная среда для размножения и раннего развития, поэтому амниоты не привязаны к водоемам. В этом состоит эволюционная роль амниона.
При родах млекопитающих водная оболочка лопается, воды вытекают, а остатки амниона на теле новорождённого часто называют «рубашечкой», которая повсеместно с давних времён является знаком удачи и прочих суеверий (отсюда, в частности, русская поговорка про тех, кто «в рубахе родился»).
Аллантоис (от греч. allantoeid?s — колбасовидный) — эмбриональный орган дыхания высших позвоночных животных; зародышевая оболочка, развивающаяся из задней кишки эмбриона. Кроме того, аллантоис участвует в газообмене зародыша с окружающей средой и выделении жидких отходов. Аллантоис, вкупе с другими эмбриональными оболочками — амнионом и хорионом, является определящим признаком высших позвоночных животных — млекопитающих, птиц и рептилий.
У яйцекладущих птиц и рептилий аллантоис развивается вокруг эмбриона вдоль стенок скорлупы. В своём внешнем слое, называемым мезодермой , он создаёт разветвлённую сеть кровеносных сосудов, с помощью которых происходит взаимодействие с внешней средой. У млекопитающих аллантоис входит в состав пуповины.
Существует несколько способов заражения развивающегося куриного эмбриона: на хорионаллантоисную оболочку, в аллантоисную и амниотическую полости, желточный мешок, тело эмбриона.
Заражение на хорионаллантоисную оболочку применяется для выделения и культивирования вирусов, образующих на оболочках бляшки (вирусы вакцины, натуральной оспы, простого герпеса). Перед заражением яйца просвечивают с помощью овоскопа, карандашом очерчивают границу воздушного пространства и хорионаллантоисной оболочки. Поверхность яйца над воздушным пространством и в месте заражения протирают спиртом, прожигают, обрабатывают йодом и делают отверстие в полости воздушного мешка.
На месте заражения скорлупу удаляют так, чтобы не повредить подскорлупную оболочку, которую затем прокалывают короткой стерильной иглой, чтобы не повредить хорионаллантоисную оболочку. Воздух из полости воздушного мешка отсасывают. Вирусный материал (0,05 - 0,2 мл) наносят на хорионаллантоисную оболочку туберкулиновым шприцем с короткой иглой или пастеровской пипеткой. Отверстие в скорлупе закрывают стерильным покровным стеклом или тем же выпиленным кусочком скорлупы и по краям заливают расплавленным парафином. Зараженные эмбрионы располагают на подставке горизонтально и инкубируют в термостате. Вскрытие эмбрионов производится не раньше 48 часов инкубации. На зараженной оболочке обнаруживаются беловатые непрозрачные пятна разной формы (бляшки).
Заражение в аллантоисную полость . Вирус, введенный в аллантоис, размножается в эндодермальных клетках, переходя затем в аллантоисную жидкость. Заражение осуществляют следующим способом: в скорлупе над воздушной камерой острием скальпеля или ножниц производят прокол, после чего через отверстие в вертикальном направлении вводят иглу со шприцем, которая проходит через хорионаллантоисную оболочку и попадает в аллантоисную полость, материал вводится в объеме 0,1 мл и отверстие заливают парафином.
Заражение в желточный мешок. С этой целью используют эмбрионы 5 - 10-дневного возраста. Наиболее употребительны два метода заражения. По первому материал вводится через воздушное пространство. В центре яйца делают отверстие, помещают его на подставку тупым концом вправо и через отверстие в вертикальном направлении вводят иглу, надетую на шприц, игла проходит через хорионаллантоисную оболочку, аллантоисную полость в желток. В желточный мешок можно ввести от 0,1 до 0,5 мл вируссодержащего материала. После заражения отверстие в скорлупе заливают парафином, и эмбрион помещают в термостат. По второму методу на границе воздушного пространства с той стороны, где лежит желток (стороны, противоположной от эмбриона), делают прокол скорлупы, через который вводят инфекционный материал. Направление иглы должно быть к центру яйца.
Куриный эмбрион, инфицированный вирусным материалом, ставят в инкубатор на 2-3 дня, в зависимости от характера внесенного вируса. Для развития вирусов из проб, взятых у больного (например, смывов из носоглотки, использующихся при диагностировании гриппа), куриный эмбрион представляет хорошую среду. По типу изменений, скажем в тканях хорионаллантоисной оболочки, можно непосредственно определить, с каким вирусом мы имеем дело. Очень характерные изменения дают вирусы оспы и герпеса. Некоторые вирусы очень интенсивно размножаются в различных тканях куриного эмбриона и дают исходный материал для приготовления вирусных антигенов, необходимых при лабораторной диагностике вирусных заболеваний. Вирусы, размноженные в курином эмбрионе, были использованы как исходный материал для получения восемнадцати видов прививочных вакцин.
Несмотря на положительные стороны культур клеток, получивших столь широкое распространение в современных вирусологических лабораториях, куриный эмбрион во многих случаях сохранил свое первенствующее значение и по-прежнему служит классическим материалом для работы. Индикация вируса в курином эмбрионе производится по гибели эмбриона, положительной реакции гемагглютинации на стекле с аллантоисной или амниотической жидкостью, по образованию фокусных поражений («бляшек») на хорион-аллантоисной оболочке, а также в РГА.
Для вирусологических исследований используют куриные эмбрионы 7-12-дневного возраста (чаще всего 9-12 дневные , иногда 5-12 дневные).
Перед заражением определяют жизнеспособность эмбриона. При овоскопировании живые эмбрионы подвижны, хорошо виден сосудистый рисунок. Простым карандашом отмечают границы воздушного мешка. Заражают куриные эмбрионы в асептических условиях, стерильными инструментами, предварительно обработав скорлупу над воздушным пространством йодом или спиртом.
Методы заражения куриных эмбрионов могут быть различны: нанесение вируса на хориоаллантоисную оболочку, в амниотическую и аллантоисную полости, в желточный мешок, тело зародыша. Выбор метода заражения зависит от биологических свойств изучаемого вируса.
Существует два способа заражения куриных эмбрионов:
1) открытый – скорлупу над воздушным мешком обрабатывают спиртом и йодом, при помощи острых ножниц срезают скорлупу, снимают верхний листок оболочки воздушного мешка и проводят заражение. Отверстие закрывают специальной стеклянной крышкой или скорлупой и герметизируют стерильным растопленным парафином.
2)Закрытый - скорлупу над воздушным мешком обрабатывают спиртом и йодом, делают колющим инструментом отверстие в скорлупе и вводят при помощи шприца с толстой иглой 0,1-0,2 мл вируссодержащего материала под контролем овоскопа. Отверстие закрывают стерильным расплавленным парафином.
Зараженные эмбрионы инкубируют в термостате 2-4 суток. Затем их охлаждают до 4ºС на протяжении суток для максимального сужения сосудов. Вскрывают в стерильных условиях, предварительно обработав скорлупу спиртом или йодом.
Индикация вируса в курином эмбрионе производится по гибели эмбриона, положительной реакции гемагглютинации на стекле с аллантоисной или амниотической жидкостью, по фокусным поражениям («бляшкам») на хорион-аллантоисной оболочке.
Культивировать вирусы возможно только в живых клетках. Для этого используют любую биологическую систему: животные организмы, куриные эмбрионы, культуры клеток. При выборе лабораторных животных необходимо выполнять следующие требования: - животные должны быть здоровы. Вновь поступивших в виварий содержат в карантине (мышей и крыс 14 дней, остальных - 21 день). Для исключения латентных (скрытых) инфекций вирусной этиологии.
Для всех животных выполняются требования: - животные должны быть чувствительными к данному вирусу; - возраст животного имеет большое значение: наиболее чувствительны молодые и новорожденные, но в некоторых случаях для выявления ярких клинических признаков болезни используют взрослых животных; - животные должны быть одного возраста и массы тела; лучше для этого подходят линейные животные, т.е. полученные в результате близкородственного скрещивания.
При вирусологических исследованиях применяют подкожное, накожное, внутрикожное, внутримышечное, внутрибрюшинное, внутривенное, пероральное, интраназальное, интрацеребральное заражение лабораторных животных.
Выделение вирусов на лабораторных животных.
Выбор лабораторных животных зависит от вида вируса. Лабораторные животные являются биологической моделью. Иногда приходится проводить 3-5 «слепых», безсимптомных пассажей, прежде чем удастся адаптировать вирус к лабораторным условиям. Однако, к некоторым вирусам лабораторные животные не чувствительны, в этом случае приходится использовать естественно восприимчивых животных. Как, например, при чуме свиней и инфекционной анемии лошадей.
Цель заражения лабораторных животных:
1. Изучить патогенез болезни;
2. Выделить вирус из пат.материала;
3. Наработка иммунных и гипериммунных сывороток;
4. Наработка вакцин;
5. Поддержание вирусов в условиях лаборатории;
6. Титрация, с целью определения количества вируса в единице объема;
7. Биологическая модель для постановки реакции нейтрализации;
Выбор метода заражения лабораторных животных зависит от тропизма вируса. Так, при культивировании нейротропных вирусов животных заражают в мозг; респираторных интранозально, интратрахеально; дерматропных - подкожно и внутрикожно.
Заражение производят с соблюдением правил асептики и антисептики.
Различают много способов введения вируссодержащего материала в организм животных:
Подкожный; - Интрацеребральный; - Внутрикожный;
Интраперитониальный; - Внутримышечный; - Интраокулярный;
Внутривеннвй; - Интранозальный; - Алиментарный;
После заражения животных метят, помещают их в изолированный бокс и ведут наблюдение в течение 10 суток. Гибель животного в первые сутки после заражения считается неспецифичной и в дальнейшем не учитывается.
3 признака указывают на результативность заражения:
Наличие клинических признаков
Гибель животного
Патологоанатомические изменения (величины, формы, цвета и консистенции органа).
Куриный эмбрион - это оплодотворенное куриное яйцо, в котором развивается зародыш (эмбрион). Культивирование вирусов на куриных и перепелиных эмбрионах в последнее время получило широкое распространение как один из наиболее простых и надежных методов культивирования и диагностики многих вирусов и некоторых бактерий - бруцеллы, риккетсии, вибрионы.
Многие вирусы человека и животных способны культивироваться в развивающихся куриных эмбрионах. Эмбриональная ткань, особенно оболочки эмбриона, богатые тканями зародышевого эпителия, является благоприятной средой для размножения многих вирусов. Вирусы, имеющие эпителиотропные свойства (оспа, ИЛТ и др.), успешно развиваются на хорионаллантоисной мембране, вызывая макроскопически видимые изменения. Различные представители миксовирусов (грипп, болезнь Ньюкасла, чума плотоядных и др.), вирусы инфекционного бронхита, гепатита утят, арбовирусы и др. хорошо размножаются в эмбрионе при введении материала в аллантоисную полость. Некоторые вирусы успешно культивируются в желточном мешке.
Преимущества:
1. Экономически выгодно, кроме того яйца легко доступны;
2. У развивающихся куриных эмбрионов отсутствуют защитные механизмы, т.к. система иммунитета еще не развита;
3. Скорлупа яиц препятствует проникновению через неё бактерий и вирусов из окружающей среды;
Для культивирования и выделения вирусов на куриных эмбрионах требуется очень несложное оборудование - обычный термостат или инкубатор.
Условия:
1. Яйца получают из хозяйств заведомо благополучных по инфекционным заболеваниям;
2. Куриные эмбрионы лучше получать от белых пород кур (леггорн, русская белая), т. к. они более устойчивы к манипуляциям и не гибнут от маленьких травм. Кроме того, у них скорлупа белая и более прозрачная, чем у других пород, и легче просвечивается, что удобно для просмотра и наблюдения в процессе работы с ними;
3. Для инкубирования отбирают оплодотворенные яйца снесенные не более 10 суток тому назад;
4. Берут незагрязненные яйца, т. к. мыть их перед инкубированием нельзя, а грязные яйца хуже просвечиваются при просмотре (овоскопии) и при работе с ними можно инфицировать эмбрион в процессе манипулирования;
Инкубируют яйца в инкубаторе или в термостате с водяным нагревом и доступом воздуха, причем в процессе инкубации в термостате яйца 2-3 раза в сутки нужно переворачивать и для лучшего газообмена вынимать на 5-10 минут на воздух. Для поддержания определенной влажности в термостат ставят сосуд с водой для испарения, температура в термостате должна быть 38°.
Развитие зародыша происходит уже в первые сутки инкубирования, происходит закладка головного мозга, скелета. Строение куриного эмбриона в возрасте 7-9 дней (см. тетрадь).
Для заражения наиболее часто используют эмбрионы 7-12 суточного возраста. Работу с куриными эмбрионами проводят в стерильной комнате-боксе со строжайшим соблюдением асептики.
Цель заражения куриных эмбрионов:
1. Выделить вырус из пат.материала;
2. Наработка вакцин;
3. Поддержание вируса в условиях лаборатории;
4. Титрация вирусов;
5. Биологическая модель для постановки реакции нейтрализации;
6. Изучение интерференции вирусов и наработка интерферона; Заражение куриных эмбрионов:
Для заражения нужно отбирать жизнеспособные эмбрионы с хорошо выраженной подвижностью. Перед заражением все эмбрионы тщательно просматривают в затемненной комнате на овоскопе
Во время просвечивания эмбрионов перед заражением на скорлупе простым карандашом обрисовывают пугу (воздушную полость), ход крупных кровеносных сосудов и место предлежания эмбриона, т. е. участок на скорлупе, где ближе всего к ней лежит эмбрион. Отметка пуги, места предлежания эмбрирна и хода крупных кровеносных сосудов затем служат ориентиром при выборе места введения вируссодержащего материала в момент заражения.
Отобранные для заражения куриные эмбрионы переносят в бокс, где и проводят с ними работу. Перед заражением скорлупу по месту введения материала дважды обрабатывают йодированным спиртом и обжигают. Доза заражения составляет 0,1-0,2 см.
В зависимости от вида вируса и цели заражения имеются различные методы введения вируссодержащего материала:
1) Заражение на хорионаллантоисную оболочку , используют эмбрионы 7-12-суточного возраста при выделении и культивировании нейротропных, дерматропных н некоторых пантропных вирусов (оспа, энцефаломиелит, ИЛТ, ящур, бешенство, чума и др.). Существует 3 варианта заражения:
а) вскрывают пугу и срезают ее ножницами, отделяют подскорлупную оболочку и наносят на хорионаллантоисную оболочку (ХАО) материал. Отверстие в яйце затем закрывают стерильным стеклянным колпачком и края колпачка парафинируют;
б) выпиливают надфилем (напильничек) или зазубренным скальпелем в скорлупе треугольник с длиной сторон около 1 см на границе пуги со стороны предлежания эмбриона, пинцетом удаляют участок скорлупы и подскордупной оболочки и вводят материал. Отверстие закрывают покровным стерильным стеклом и края парафинируют, или заклеивают стерильным лейкопластырем.
в) скальпелем удаляют небольшой участок скорлупы площадью около 0,5 см по месту предлежания эмбриона, затем пинцетом или иглой удаляют в этом участке подскорлупную оболочку и вводят материал. Если материал плохо входит в полость яйца, можно с помощью резиновой груши через отверстие в скорлупе на пуге откачать воздух из пуги и в результате по месту введения материала образуется искусственная пуга и тогда материал легко вводится. Отверстие в скорлупе закрывают лейкопластырем или парафинируют.
2) Заражение в аллантоисную полость. Этот метод заражения очень прост и применяется для выделения многих вирусов. Для заражения берут 10-11-дневные эмбрионы. Имеется два варианта заражения:
а) заражение проводят через пугу, не срезая ее. Иглой отмеряют расстояние от верхушки пуги до границы пуги, отмеченной карандашом на скорлупе, и вводят иглу на отмеченную глубину и углубляют еще на 0,5 см, чтобы проколоть хорионаллантоисную оболочку;
б) вводят материал иглой через прокол в скорлупе в месте предлежания эмбриона на глубину 3-5 мм в бессосудистом участке. Отверстие в скорлупе закрывают лейкопластырем или парафинируют.
3) Заражение в желточный мешок. Для заражения используют 5-8-суточные эмбрионы. Существует два варианта заражения:
а) иглу вводят со стороны пуги в желточный мешок под углом 45° к месту предлежания эмбриона под контролем овоскопа;
б) яйцо кладут на подставку также местом предлежания эмбриона вниз и иглу вводят сверху вниз по направлению к эмбриону на глубину около 1 см.
Место введения заклеивают лейкопластырем и парафинируют. 4) Заражение в амниотическую полость. При этом методе заражения вирус может проникнуть в различные клетки, находящиеся в контакте с амниотической жидкостью, и размножаться в них. для удобства заражения рекомендуется за 2-3 дня до проведения заражения эмбрионы инкубировать пугой вверх. Тогда эмбрион и амнион смещаются вверх и удобнее заражать. Имеется два варианта заражения:
а) вскрывают и срезают пугу, пинцетом удаляют подскорлупную оболочку и захватывают амниона подтягивают амнион пинцетом и вводят в амниотическую полость материал в дозе 0,1 мл. Отверстие в скорлупе затем закрывают стерильным стеклянным колпачком и края парафинируют;
б) заражение с помощью длинной иглы через пугу в темной комнате под контролем глаза, У иглы предварительно острие загибают под прямым углом, чтобы получилась маленькая площадка. Иглу вводят под контролем глаза через пугу доэмбриона, под давлением затупленной иглы эмбрион в этом случае будет смещаться, затем легким толчком прокалывают амнион и иглу слегка оттягивают назад. При этом эмбрион должен смещаться за иглой вверх. Затем вводят материал.
5) Заражение в тело эмбриона и заражение в головной мозг. Используются 7-12-дневные эмбрионы, заражение проводят введением материала в различные участки тела или непосредственно в головной мозг. Для заражения вскрывают пугу и подтягивают пинцетом эмбрион. При этих методах заражения может быть гибель эмбрионов от травмы до 30 % и более от числа зараженных.
6) Заражение в крупные кровеносные сосуды хорионаллантоисной оболочки. Этот метод заражения, как и предыдущий, применяется очень редко. Материал вводят тонкой иглой после удаления скорлупы по ходу кровеносного сосуда непосредственно в сосуд по току крови.
После заражения куриные эмбрионы обязательно метят простым карандашом и ставят в термостат. За ними ежедневно наблюдают путем просмотра, наблюдение ведут до 7-8 дней в зависимости от вида вируса. В случае гибели эмбрионов их срочно удаляют из термостата и ставят в холодильник до момента вскрытия. Если эмбрион погиб в течение первых 14-18 часов, это может быть от травмы или токсичности патматериала. Поэтому, так же как и при заражении лабораторных животных, в сомнительных случаях рекомендуется, делать несколько пассажей и в опыт брать на каждый материал по несколько эмбрионов.
Вскрытие погибших зараженных куриных эмбрионов, или изъятых по истечении срока наблюдения производится со всеми правилами асептики в стерильных условиях бокса. При вскрытии скорлупу обрабатывают спиртом и обжигают, затем срезают пугу. У вскрытого эмбриона сначала тщательно отсасывают аллантоисную жидкость (количество ее около 7 мл), затем пинцетом оттягивают амниотическую оболочку, прокалывают пастеровской пипеткой и отсасывают амниотическую жидкость (количество ее 1,0-1,5 мл), затем собирают желток, извлекают оболочки и сам эмбрион. Жидкость, оболочки и сам эмбрион тщательно осматривают на наличие изменений. Амниотическая жидкость в норме совершенно прозрачная, при заражении она может быть мутная, кровянистая. Характерные изменения, вызванные вирусом, бывают наиболее выраженными на хорионаллантоисной оболочке: появляютсявоспалительные очаги, непрозрачные, круглой формы и кровоизлияния. Кровоизлияния могут быть на теле эмбриона. Весь материал собирают в стерильную посуду.
Куриные эмбрионы в вирусологии широко применяются не только для выделения вирусов, но и для накопления и получения антигенов, для приготовления живых и убитых вакцин, титрования вирусов, для постановки реакции нейтрализации вирусов, для аттенуирования (ослабления) вирусов, для изучения интерференции вирусов и получения интерферона.
Подготовила: преподаватель Угышева Ш.Е.
Слайд 3
Строение вирусов
Слайд 4
Структура вирусов A – простой вирус B – сложный вирус
Слайд 5
За своей степенью опасности вирусы разделяют на четыре группы: I группа: возбудители лихорадки Эбола, Ласса, Марбурга, Мачупо, натуральной оспы, а также вирус гепатита В (мартышек). ІІ группа: арбовирусы, некоторые аренавирусы, вирусы бешенства, вирусы гепатита С и В человека, ВИЧ. ІІІ группа - вирусы гриппа, полиомиелита, энцефаломиокардита, осповакцины. ІV группа - аденовирусы, коронавирусы, герпесвирусы, реовирусы, онковирусы.
Слайд 6
Слайд 7
Принципы классификации вирусов Тип нуклеиновой кислоты, ее структура, стратегия репликации Размеры, морфология, симметрия вириона, число капсомеров, наличие суперкапсида. Наличие специфических ферментов, особенно РНК- и ДНК-ПОЛИМЕРАЗ, нейраминидазы Чувствительность к физическим и химическим агентам, особенно к эфиру Иммунологические свойства Естественные механизмы передачи Тропизм к хозяину, его тканям и клеткам Патология, формирования включений Симптоматология заболеваний.
Слайд 8
Классификация вирусов (РНК- содержащие)
Слайд 9
Классификация вирусов (ДНК- содержащие)
Слайд 10
Химический состав вирусов В состав вирусов входит нуклеиновая кислота, белок, липиды, гликолипиды, гликопротеиды. Они всегда содержат один тип нуклеиновой кислоты (ДНК или РНК), которая составляет от 1 % до 40 % массы вириона. Вирусные геномы содержат информацию, достаточную для синтеза лишь нескольких белков. Их масса достигает 10-15 мг, что в 1 млн. раз меньше, чем в клетки, а длина- до 0,093 мм Число нуклеотидных пар колеблется от 3150 (вирус гепатита В) до 230000 (вирус натуральной оспы). Белки вирусов (70-90 %) разделяются на структурные и неструктурные. Структурными - белки, которые входят в состав зрелых внеклеточных вирионов. Они выполняют ряд важных функций: - защищают нуклеиновую кислоту от внешнего повреждения взаимодействуют с мембранами чувствительных клеток обеспечивают проникновения вируса в клетку - имеют РНК- и ДНК-полиме-разную активность и др. Неструктурные белки не входят в состав зрелых вирионов, однако образуются во время их репродукции. Они: - обеспечивают регуляцию экспрессии вирусного генома - являются предшественниками вирусных белков, способные подавлять клеточный биосинтез. В зависимости от расположения в вирионе, белки разделяются на капсидные, суперкапсидные, матриксные, белки сердцевины и ассоциируемые с нуклеиновой кислотой. Липиды (15-35 %) содержатся в сложных вирусах и входят в состав суперкапсидной оболочки, образовывая ее двойной липидный слой. Они: - стабилизируют вирусную оболочку - обеспечивают защиту внутренних слоев вирионов от гидрофильных веществ внешней среды - принимают участие у депротеинизации вирионов.
Слайд 11
Репродукция вирусов. Особенности ее заключаются в том, что геномы представлен как РНК, так и ДНК, они многообра-зные за структурой и формой, почти все вирусные РНК способны реплицироватся независимо от ДНК клетки.Вирусам присущий дизъюнктивный способ репродукции, заключается в том, что синтез генома и белков вируса разорван в пространстве и времени: нуклеиновые кислоты реплиццируются в ядре клетки, белки - в цитоплазме, а сбор целых вирионов может происходить на внутренней пове-рхностицитоплазматичної мембраны. Репродукция вирусов - уникальная система воссоздания чужерод-ной информации в клетках эукариотов и обеспечивает абсолютное подчинение клеточных структур потребностям вирусов. В репродукции вирусов выделяют ряд стадий. К ранним принадлежит адсорбция вирусов на поверхности клетки, проникновение (пенетрация) их внутрь клетки и их раздевание (депротеинизация). Поздние стадии (стратегия вирусного генома) включают синтез вирусных нуклеиновых кислот, синтез белка, сбор вирионов и выход вирусных частиц из клетки.
Слайд 12
Прикрепление вирусов к поверхности клетки обеспечивается двумя механизмами: неспецифическим и специфическим. Неспецифический определяется силами электростатического взаимодействия, что возникает между химическими группами на поверхности вирусов и клеток, которые несут разные заряды. Специфический механизм (обратная и необоротная адсорбция) предопределяется комплементарними вирусными и клеточными рецепторами. Они могут иметь белковую, углеводную, липидную природу. Например, рецептором для вирусов гриппа является сиаловая кислота. Число рецепторов на участках адсорбции может достигать 3000. На поверхности вирусов рецепторы, как правило, расположены на дне углублений и щелей. Проникновение вирусов внутрь клетки происходит за механизмом рецепторного эндоцитоза (вариант виропексиса) на специальных участках клеточных мембран, которые содержат особенный блок с высокой молекулярной массой - клатрин. Мембраны инвагинируются, и образуются покрытые клатрином внутриклеточные вакуоли. их число может достигать 2000. Вакуоли, объединяясь, образуют рецептосоми, а последние сливаются с лизосомами. Поверхностные белки вирусов взаимодействуют с мембранами лизосом, а их нуклеопротеид выходит в цитоплазму. Однако существует еще один механизм проникновения вирусов в клетку - индукция слияния мембран. Она происходит благодаря особенному вирусному белку слияния (F- от fusion - слияние). В результате этого процесса вирусная липопротеидная оболочка интегрирует с клеточной мембраной, а геном его проникает в клетку. Такой белок идентифицирован у вирусов гриппа, парагриппа, рабдовирусов и др.
Слайд 13
Раздевание вирионов - многостепенный процесс, во время которого высвобождается их нуклеиновый аппарат, исчезают защитные оболочки, которые тормозят экспрессию генома. Происходит оно в специализированных участок - лизосомах, аппарате Гольджи. Поздние стадии репродукции направлены на синтез вирусных нуклеиновых кислот и белка. Механизм репликации (образование вирусных геномов, которые являются точной копией предшественника) зависит от особенностей нуклеиновой кислоты. У разных видов вирусов он неодинаковый. Репликация у вирусов, которые содержат РНК, происходит за подобными закономерностями. На материнской РНК синтезируется ИРНК, а матрицей для синтеза вирусного генома служат промежуточные формы РНК. Транскрипцией называют процесс образования информационных (матричных) РНК. Она происходит с помощью специальных ферментов, которые называются ДНК- или РНК-зависимые РНК-полимеразы. У вирусов ДНК эти ферменты клеточного происхождения, а у РНК-вирусов - собственные вирусспецифическиетранскриптазы. На стадии трансляции происходит считывание генетической информации из матричной РНК и перевод ее в последовательность аминокислот. Происходит процесс в рибосомах. Молекулы РНК продвигаются в рибосомах в соответствии с последовательностью триплетного кода, который распознают транспортные РНК. Последние несут на специальных участках аминокислоты.
Слайд 14
Слайд 15
Слайд 16
Культивирование вирусов Куриные эмбрионы 6-12 дневного возраста. Способы заражения - открытый, закрытый
Слайд 17
Культивирование вирусов Культуры клеток: - первично-трипсинизированные культуры эмбрионов человека, почек мартышек, фибробластов эмбриона курицы и тому подобное; способные расти на протяжении нескольких пасса-жей как вторичные культуры; перевиваемые клетки; они представляют собой культуры клеток, которые приобрели способность к неограниченному росту и размножению; Их получают из опухолей или из нормальных человеческих или животных тканей, которые имеют измененный кариотип. HeLa (карцинома шейки матки) Hep-2 (карцинома гортани человека), КВ (карцинома ротовой полости человека), RD (рабдомиосаркома человека), RH (почка эмбриона человека), Vero (почка зеленой мартышки), СПЭВ (почка эмбриона свиньи), ВНК-32 (почка сирийского хомяка). Культуры клеток диплоидные клетки; они представляют собой культуры клетки одного типа, имеют диплоид-ный набор хромосом и способные выдерживать при этом до 100 пересеваний в условиях лабора-тории. Они являются удобной моделью для получения вакцинных препаратов вирусов, так как свободные от контаминации инородными вирусами, хранят исходный кариотип во время пассажей, не имеют онкогенной активности. Чаще всего пользуются линиями культур, которые получены с фибробластов эмбриона человека (WI-38, MRC-5, MRC-9, IMR-90), коров, свиней, овец и тому подобное. Культуры клеток хранят в замороженном состоянии.
Слайд 18
Питательные среды, которые используются для поддержки культур клеток или их роста бывают естественными или синтетическими (искусственными). Естественные среды - сыворотка крови крупного рогатого скота, жидкости из серозных полостей, продукты гидролиза молока, многообразные гидролизаты (5 % гемогидролизат, 0,5 % гидролизатлактоальбумина) или экстракты тканей. Их химический состав помогает создать условия, какие подобные к тем, что существуют в организме человека. Существенным недостатком таких сред считается их нестандартность, ведь качественный и количественный состав компонентов, которые входят к их составу, может изменяться. Синтетические питательные среды не имеют этого недостатка, ведь их химический состав стандартен, потому что их получают комбинируя многообразные солевые растворы (витамины, аминокислоты) в искусственных условиях. К таким наиболее употребимым растворам принадлежат среда 199 (культивирование первинно-трипсинизированных и перевиваемых культур клеток), среда Игла (содержит минимальный набор аминокислот и витаминов и используется для культивирования диплоидных линий клеток и перевиваемых), среда ИглаМЕМ (культивирование особенно требовательных линий клеток), раствор Хенкса, что используется для изготовления питательных сред, отмывания клеток и тому подобное
Слайд 19
Слайд 20
Слайд 21
Заражение лабораторных животных. Многочисленные лабораторные животные широко используются в вирусологии для выделения и идентификации вирусов, получения специфических противовирусных сывороток, изучения многообразных аспектов патогенеза вирусных заболеваний, разработки способов борьбы с заболеваниями и их профилактики. Чаще всего используют белых мышей разного возраста (двухдневного возраста), белых крыс, гвинейских свинок, кролей, сусликов, хлопчатниковых крыс, мартышек и других.
Слайд 22
Существуют многообразные способы заражения животных в зависимости от тропизма вирусов, клинической картины заболевания. Исследуемый материал можно вводить: - через рот - в дыхательные пути (ингаляторно, через нос) - накожный - внутрикожно - подкожно, внутримышечный - внутривенно - внутрибрюшинно - внутрисердечно - на скарифицированную роговицу - в переднюю камеру глаза - в мозг.
Слайд 23
Слайд 24
Слайд 25
Слайд 26
Бактериофа́ги (фаги) (от др.-греч.φᾰγω - «пожираю») - вирусы, избирательно поражающие бактериальные клетки. Чаще всего бактериофаги размножаются внутри бактерий и вызывают их лизис. Как правило, бактериофаг состоит из белковой оболочки и генетического материала одноцепочечной или двуцепочечнойнуклеиновой кислоты (ДНК или, реже, РНК). Размер частиц приблизительно от 20 до 200 нм. Независимо от Фредерика Туорта французско-канадский микробиолог Д’Эрель, Феликс 3 сентября 1917 год сообщил об открытии бактериофагов. Наряду с этим известно, что российский микробиолог Николай Фёдорович Гамалея ещё в 1898 году, впервые наблюдал явление лизиса бактерий (сибиреязвенной палочки) под влиянием перевиваемого агента. Жизненный цикл Умеренные и вирулентные бактериофаги на начальных этапах взаимодействия с бактериальной клеткой имеют одинаковый цикл. Адсорбция бактериофага на фагоспецифических рецепторах клетки. Инъекция фаговой нуклеиновой кислоты в клетку хозяина. Совместная репликация фаговой и бактериальной нуклеиновой кислоты. Деление клетки. Далее бактериофаг может развиваться по двум моделям: лизогенный либо литический путь. Умеренные бактериофаги после деления клетки находятся в состоянии профага (Лизогенный путь). Вирулентные бактериофаги развиваются по Литической модели: Нуклеиновая кислота фага направляет синтез ферментов фага, используя для этого белоксинтезирующий аппарат бактерии. Фаг тем или иным способом инактивирует ДНК и РНК хозяина, а ферменты фага совсем расщепляют её; РНК фага «подчиняет» себе клеточный аппарат синтеза белка. Нуклеиновая кислота фага реплицируется, и направляет синтез новых белков оболочки. Образуются новые частицы фага в результате спонтанной самосборки белковой оболочки (капсид) вокруг фаговой нуклеиновой кислоты; под контролем РНК фага синтезируется лизоцим. Лизис клетки: клетка лопается под воздействием лизоцима; высвобождается около 200-1000 новых фагов; фаги инфицируют другие бактерии. 1 - головка, 2 - хвост, 3 - нуклеиновая кислота, 4 - капсид, 5 - «воротничок», 6 - белковый чехол хвоста, 7 - фибрилла хвоста, 8 - шипы, 9 - базальная пластинка
Слайд 27
Заражение куриного эмбриона Куриный эмбрион используется для культивирования вирусов, микоплазм. Используют эмбрионы в возрасте 8-14 дней в зависимости от вида вируса и способа заражения; на хорион-аллантоисную оболочку, в аллантоисную и ам-ниотическую полость, в желточный мешок. Перед-заражением определяют жизнеспособность эмбриона в овоскопе и отмечают карандашом на скорлупе границы воздушного мешка. Заражение куриных эмбрионов производят в боксе в строго асептических условиях, пользуясь инструментом, стерилизованным кипячением. Скорлупу над воздушным пространством протирают спиртом, обжигают в пламени, смазывают 2% раствором йода, снова протирают спиртом и обжигают. Вирусный материал в количестве 0.05 - 0.2 мл наносят на хорион-аллантоисную оболочку туберкулиновым шприцом или пастеровской пипеткой. Вскрытие эмбрионов производят через 48 - 72 часа инкубации в термостате. Наличие вируса в хролантоиской оболочке определяют: 1. По белесоватым непрозрачным пятнам разной формы; 2. В реакции гемаглютинации.
Слайд 28
Слайд 29
Слайд 30
Слайд 31
Спасибо!!!
Посмотреть все слайды
Цель занятия
Ознакомить студентов с методами отбора куриных эмбрионов для культивирования вирусов.
Оборудование и материалы
Куриные эмбрионы 9-12 дневного возраста инкубации, овоскоп, спиртовые тампоны, подставки для эмбрионов, пинцеты, ножницы, лейкопластырь, иглы, шприцы, простые карандаши, пробойники, иголочки, таблицы, схемы, мультимедийное оборудование, презентации MS Office Power Point по теме занятия.
Методика проведения занятия и методические указания по теме
Объяснение преподавателя
Культивирование вирусов на куриных эмбрионах наиболее доступный и удобный метод для первичного выделения вируса. Практика применения этого метода заражения показала ряд преимуществ перед другими методами. Для заражения используют эмбрионы 5-12 дневной инкубации.
ДОСТОИНСТВА И НЕДОСТАТКИ КУРИНЫХ ЭМБРИОНОВ КАК БИОЛОГИЧЕСКИХ ОБЪЕКТОВ
Культивирование вирусов в куриных эмбрионах – наиболее доступный и удобный метод как для первичного выделения вирусов от больных животных и из объектов внешней среды, так и для последующего культивирования вирусов в лаборатории. Этот метод широко применяется для идентификации вирусов и антител, а также для приготовления вакцин и диагностикумов. Практика применения показала ряд преимуществ этого метода перед культивированием вирусов на лабораторных животных. Известно, что белые мыши, которых широко используют при вирусологических исследованиях, могут быть спонтанно заражены рядом вирусных инфекций: эктромелией, лимфоцитарным хориоменингитом, энцефалитом Тейлора, вирусной пневмонией, вирусом Сендай и другими, что крайне осложняет работу и нередко приводит к ошибочным выводам при оценке получаемых результатов. Культивирование вирусов на куриных эмбрионах в значительной мере устраняет указанные выше трудности. Наряду с этим от куриного эмбриона можно получить значительно большее количество вируса, чем от лабораторных животных. Куриный эмбрион обладает большей жизнеспособностью и устойчивостью к разного рода воздействиям, неизбежным при введении исследуемого материала. При известном навыке работы с эмбрионами и соблюдении правил асептики гибель их незначительна. Наибольший отход эмбрионов бывает при введении материала в амниотическую полость и желточный мешок, но и в этих случаях она не превышает 10–15 %, если соблюдены необходимые условия инкубирования.
Куриные эмбрионы как живая система вошли в вирусологическую практику в 30-х годах XX в. Их использование расширило спектр культивируемых в лабораторных условиях вирусов, позволило более успешно решать стоящие перед вирусологией задачи в связи с тем, что куриные эмбрионы имеют ряд преимуществ перед лабораторными животными: 1)скорлупа и подскорлупная оболочка надежно защищают эмбрион от бактериального заражения со стороны внешней среды; 2) важным преимуществом эмбрионов является также их высокая чувствительность к широкому спектру вирусов, что объясняется недостаточным развитием защитных механизмов; 3) куриные эмбрионы легкодоступный объект в связи с развитием широкой сети птицефабрик и инкубаториев; 4) куриные эмбрионы экономичны, не требуют ухода и кормления.
Основными недостатками являются: 1) невозможность полностью гарантировать стерильность этой живой системы, так как эмбрионы могут нести в своем содержимом вирусы и другие патогенные агенты (вирусы инфекционного бронхита кур, ньюкаслской болезни, гриппа, лейкоза, хламидии и микоплазмы). Их присутствие может искажать результаты исследования; 2) куриные эмбрионы чувствительны не ко всем вирусам.
ЦЕЛИ ИСПОЛЬЗОВАНИЯ КУРИНЫХ ЭМБРИОНОВ
Используют куриные эмбрионы в вирусологии в основном для тех же целей, что и лабораторных животных, а именно:
– обнаружения в патматериале активного вируса биопробой;
– первичного выделения вируса. Эффективно выделяют и культивируют на куриных эмбрионах вирусы, вызывающие заболевания у птиц, а также некоторые вирусы млекопитающих;
– поддержания вирусов в лаборатории;
– титрования вирусов;
– накопления вируса для лабораторных исследований и получения вакцин;
– как тест-объект в реакции нейтрализации.
ТРЕБОВАНИЯ К КУРИНЫМ ЭМБРИОНАМ
Яйца необходимо получать из благополучных по вирусным болезням хозяйств. В оплодотворенных яйцах даже от клинически здоровых кур могут находиться различные встречающиеся у этих птиц вирусы: ньюкаслской болезни, инфекционного бронхита, инфекционного ларинготрахеита, энцефаломиелита, парагриппа-2, полиартрита, оспы, арбовирусы, аденовирусы и др. Присутствие этих вирусов может, с одной стороны, привести к диагностическим ошибкам, а с другой, на основе явления интерференции, – к подавлению размножения вируса, находящегося в исследуемой пробе. Эмбрионы, не содержащие вируса, но полученные от кур, бессимптомно зараженных определенными вирусами, также могут быть менее чувствительны или абсолютно нечувствительны к действию данного вируса благодаря наличию специфических антител, полученных от матери с желтком. Для удачного выделения вируса необходимо, чтобы куры, эмбрионы которых используют в работе, не были вакцинированы против болезни, возбудителя которой ищут. Скорлупа яиц должна быть непигментированной, чистой (мыть нельзя). Возраст эмбриона должен соответствовать избранному методу заражения.
Для обеспечения нормального развития зародышей в оплодотворенных яйцах в период инкубации необходимо соблюдать определенную температуру и влажность. Развивающиеся эмбрионы переносят перегрев значительно хуже, чем охлаждение. Поэтому кратковременная (в течение нескольких часов) поломка в системе обогрева не приносит большого вреда. При более длительном перерыве необходим подогрев.
Инкубируемые яйца нуждаются в свободном доступе свежего воздуха, который поступает через отдушины. Они должны быть всегда открытыми. Одно яйцо, как принято считать, расходует 1 л кислорода в день, что неудивительно, если вспомнить о бурном развитии зародыша в течение 21 дня инкубации. Именно поэтому яйца нельзя класть вплотную, а также одно на другое. Для инкубации яиц непригодны обычные термостаты. Лишь в случае крайней необходимости их можно использовать для этих целей, но при этом часто проветривать ипоставить внутрь сосуд с водой для обеспечения требуемой влажности.
Заложенные на инкубацию яйца через 3–5 дней просвечивают с помощью специальной настольной или ручной (если яйца не вынимают из лотка инкубатора) лампы, чтобы отобрать неоплодотворенные. Наиболее удобны для вирусологических работ яйца леггорнов, так как их тонкая белая скорлупа позволяет лучше рассмотреть содержимое. Неоплодотворенные или содержащие погибших зародышей яйца из инкубатора удаляют. Доля оплодотворенных яиц колеблется в значительных пределах в зависимости от многих факторов, в том числе от времени года: весной она самая высокая, зимой самая низкая.
Второй раз зародыши просвечивают в день запланированного заражения. Срок этот зависит от вида вируса, а также пути его введения. На скорлупе обычным (не чернильным) карандашом отмечают место заражения.
СТРОЕНИЕ КУРИНОГО ЭМБРИОНА
Обычно курица откладывает оплодотворенное яйцо, в котором зародыш находится на стадии бластулы или ранней гаструлы. При нагревании яйца до температуры, близкой к температуре тела курицы, происходит дальнейшее развитие зародыша (рис. 15). В период с 5-го по 12-й день инкубации куриные эмбрионы могут быть использованы для заражения вирусами.
Рисунок 15 - Схематический разрез куриного эмбриона на 8-й день инкубации: 1 – скорлупа; 2 – подскорлупная оболочка; 3 – хорионаллантоисная оболочка; 4 – аллантоисная полость; 5 – желточный мешок; 6 – белок; 7 – воздушная камера; 8 – тело зародыша; 9 – амниотическая полость
Яйцо с развивающимся куриным эмбрионом покрыто снаружи твердой пористой скорлупой, к которой плотно прилегает подскорлупная оболочка. Последняя в тупом конце яйца разделяется на два листка, между которыми образуется воздушная камера. Тело зародыша лежит в яйце эксцентрично, спиной ближе к скорлупе, голова направлена в сторону воздушной камеры. Зародыш погружен в околоплодную жидкость, заполняющую амниотическую полость, и пуповиной связан с желтком. Желток также располагается эксцентрично и относительно зародыша как бы по другую сторону продольной оси.
Непосредственно под подскорлупной оболочкой находится аллантоисная полость, покрывающая амнион и желточный мешок, а к 10-11-му дню замыкающаяся в остром конце яйца. В процессе развития аллантоисная оболочка срастается с хорионом, образуя единую хорионаллантоисную оболочку (ХАО). В остром конце яйца находится остаток белка.
Заражение в ту или другую часть эмбриона проводится в период ее максимального развития, когда количество чувствительных клеток будет наибольшим.
В процессе инкубации меняются размеры зародышевых структур, что во многом объясняется их функциональным назначением и определяет оптимальный для заражения возраст эмбриона.
Так, желточный мешок как резервуар питательных веществ имеет наибольший объем в начале инкубации, а затем (после 12-го дня) по мере развития зародыша он уменьшается. Заражают в желточный мешок с 5-го по 7-й день инкубации.
Амниотическая полость, являясь буферной средой развития зародыша, покрывает его уже на 5-й день инкубации. Среднее количество жидкости к середине периода инкубации составляет около 1 мл.
Для заражения в амниотическую полость используют эмбрионы в возрасте 6-10 дней.
Аллантоисная полость служит для сбора продуктов обмена, в ней скапливаются мочекислые соли, фосфорные и азотистые соединения. В процессе роста и развития зародыша аллантоисная жидкость приобретает кислую реакцию. Максимальных размеров аллантоисная полость достигает на 9-12-й день развития эмбриона, поэтому заражение в аллантоисную полость проводят преимущественно на 9-11-й день инкубации.
Хорионаллантоисная оболочка богата кровеносными сосудами, которые, тесно прилегая к внутренней поверхности пористой скорлупы, насыщаются кислородом и снабжают им тело зародыша, выполняя функцию органа дыхания эмбриона. Максимального развития ХАО достигает на 11-13-й день. Заражение на хорионаллантоисную оболочку проводят на 10-12-й день инкубации.
ПОДГОТОВКА КУРИНЫХ ЭМБРИОНОВ К ЗАРАЖЕНИЮ
Эмбрионы доставляют из инкубатория, не допуская их охлаждения в пути. В лаборатории эмбрионы инкубируют в термостате при температуре 37 °С и влажности 60-70 %, что достигается установлением в термостате открытых широкогорлых сосудов с водой. Вентиляционные отверстия термостата должны быть открыты. Эмбрионы размещают воздушной камерой вверх в специальных штативах. Рекомендуется до момента заражения дать возможность эмбрионам в течение суток адаптироваться к новым условиям и нормализовать свои функции после транспортного стресса. Если лаборатория располагает собственным инкубаторием, то снесенные курицей оплодотворенные яйца пригодны для закладки в него в течение 10 дней.
Подготовка куриных эмбрионов к заражению включает овоскопирование и дезинфекцию скорлупы, а также соответствующую подготовку рабочего места. Овоскопирование представляет собой просмотр яиц против достаточно яркого источника света (овоскоп), в результате чего на неосвещенной стороне скорлупы образуются тени от внутренних структур (рис. 16). Овоскопирование проводят в затемненном помещении. При этом на скорлупе графитным карандашом отмечают границу воздушной камеры, место расположения зародыша и участок бессосудистой зоны размером 0,5x0,5 см. Эти отметки служат ориентиром при выборе места введения вируссодержащего материала. При овоскопировании также определяют, жив зародыш или погиб. Зародышей, проявляющих активные движения при хорошей кровенаполненности сосудов ХАО, считают живыми.
Рисунок 16 - Овоскопирование куриного эмбриона на 10-е сутки инкубации. Видны тени: 1 – зародыша; 2 – желточного мешка; 3 – кровеносных сосудов ХАО; 4 – воздушной камеры; 5 – белка
Куриные эмбрионы заражают в асептических условиях (лучше в боксе). В предбокснике скорлупу эмбрионов обрабатывают йодированным спиртом, затем уже в боксе повторно протирают, а иногда еще и фламбируют – обрабатывают пламенем смоченного спиртом тампона.
Эмбрионы фиксируют в специальных подставках, установленных в эмалированной кювете на 3–4-слойной марлевой салфетке, смоченной дезинфицирующим раствором.
В работе используют инструменты, стерилизованные кипячением. Их ставят в баночку со спиртом и обжигают пламенем горелки перед каждым повторным использованием.
Демонстрация
а) клинических признаков заболевания у зараженных лабораторных животных; б) методов умерщвления лабораторных животных; в) техники вскрытия (обращают внимание студентов на состояние внутренних органов) и приемов получения вируссодержащего материала; г) техники изготовления отпечатков мозга; д) действий по обеззараживанию рабочего места и трупа после вскрытия зараженного животного.
Задания
1.Изучить строение куриного эмбриона.
2.Провести овоскопию куриного эмбриона, определить его жизнеспособность и отметить границы теней естественных образований.
3. Подготовить куриные эмбрионы к заражению.
Самостоятельная работа студентов
а) распознавание по цветной метке зараженных каждым из студентов мышей, анализ их клинического состояния, умерщвление, фиксация в кювете с восковым (парафиновым) дном, вскрытие; б) анализ патологоанатомических изменений, получение вируссодержащего материала (паренхиматозных органов), приготовление послойных отпечатков мозга.
Студенты проводят овоскопию куриного эмбриона, определяют его жизнеспособность и отмечают границы теней естественных образований.
Подведение итогов занятия
Задание к следующему занятию
Контрольные вопросы
1. Строение куриного эмбриона.
2. Для чего используют куриные эмбрионы в вирусологии?
3. Каково строение развивающегося куриного эмбриона?